李时珍觉得自己写的医书，一定要方便后人翻阅和使用，因此书上的条例要清楚，纲目要分明。他为这本医书，起名叫做《本草纲目》。
李时珍编写《本草纲目》一书，是一项巨大的、艰难的任务。
幸好在写书过程中，得到他父亲李言闻大力的帮助和鼓励。还有几个人，也加入编著过程，成为他的得力帮手。
其中一个是他的徒弟，叫做庞宪。庞宪是蕲州人，他在小时候患病，几乎死去，是李时珍及时救活了他。庞宪长大以后，就拜李时珍为师，对李时珍十分尊敬。庞宪从小就十分乖巧，学习认真，工作踏实，待人诚恳，深受李时珍喜爱，李时珍常常带他一起外出采药问方。
另一个是他的次子李建元。李建元小时候也中过秀才，由于乡试未中举人，于是他决定向父亲学医。难得的是，李时珍这个小儿子，从小就有学医的天赋。时常跟着李时珍一起在蕲州城看病，李时珍开药方，他在边上帮忙，打下手。
为了写好《本草纲目》这本书，李时珍经常品尝各种药物的味道，对于药物，有些只有亲自品尝才能对它有真正的了解。每次品尝各种药物之后，李时珍都会及时记录下来，留作第一手资料。
鹅肠草，一种常见的草药。鹅肠草和鸡肠草，两者非常相似。李时珍发现，这两种草药经常会被人弄错。
鹅肠草味甘，茎中是空的，花为白色。而鸡肠草味道稍苦，咀嚼时口水较滑，茎中没有缕，叶的颜色微带紫色，花也是紫色的，用咀嚼品尝的办法最容易区别。
一开始李时珍也不太容易分辨出来，只有亲口尝试味道，才能分辨出来。
对于传言有毒的药物，李时珍也要谨慎地去试一试。比如蛇莓，传言会毒死人。但是李时珍服用后，并没有发现中毒。
为了能够了解药物的各种性质，李时珍还亲自栽种了一大批的药物和一些农家谷类菜类植物，以此进行亲身试验。
李时珍经过多次亲身实践，得出来宝贵经验，及时改正了一些医书的错误判断。
李时珍还亲自炼制过许多药品。比如对樟脑进行炼制。
李时珍用两个碗将一两重的樟脑盒盖住，用湿纸将边缘封上，用火烧烤。在经过一段时间后取出，等冷却后就可以用了。这是一般的方法。
还有另一种方法，就是用一些黄连、薄荷、白芷、细辛、荆芥、密蒙茌、当归等，将樟脑与这些药一起放在一个新的大土碗中，放上一些水，再用另一只碗盖上，并将口糊好，用火煨之。等水干了后取出来，樟脑就出来了。这一种方法就是现在所说的“升华法”。
对其他的药物，如轻粉、粉霜、银朱、密陀僧、玄明粉、阿胶等，李时珍都曾经亲自进行过炼制，并给予了详细的记载，所有的炼制，他都是亲自操作和记录。
蕲州的山野，到处长满了曼陀罗花。李时珍听当地百姓说，曼陀罗花的子用酒吞服后，会使人发笑。这引起他的注意，经过试验，李时珍发现，曼陀罗花真的具有麻醉作用。
他后来在书中写道：“八月间，采曼陀罗花，阴干碾成粉末，用热酒给病人调服三钱，一会儿便昏昏如醉。然后施行艾灸或外科手术，就不会感到痛苦了。”李时珍还亲自施行过这种药，做手术。
李时珍说：“石炭在南北各地不同山上产量丰富，古代人不用它，所以知道的较少。现在人们用来生火做饭，煅炼铁石。百姓都开山挖穴，到十几丈深的地方才能挖到石炭。”
李时珍深入到铅矿采挖现场，看到铅生在山穴和巨石间，矿工挟着油灯，在洞穴中深入数里，随着矿脉的上下曲折来取得，铅矿中的气体对人体有毒，如果在铅矿中连续几个月不出来，就会皮肤萎黄，腹胀不能进食，大多数会导致疾病而死亡。他详细描述了铅中毒的症状。
为了考察海产药物，李时珍还到过沿海各地。为了弄清卤碱，李时珍亲临卤地，在山西的平原和太谷、榆次的高地，在秋天都有卤碱，远望如水，近看如积雪。李时珍看到百姓将它刮下来熬成盐，稍微有苍黄色的就是卤盐。
李时珍深入各地，在群众智慧的海洋里，不断地获得真知，他广泛收集在民间流传的医药经验，并将之记入《本草纲目》之中，使之流传下来。
李时珍对在各地的所见所闻，都认真地记录下来。
他采访猎人，知道麋和鹿二者的区别，但当时的猎人一般不加区分，往往认麋为鹿。
他采访村民，记载了黄鼠的生活环境和食性，并和村民们一起用水灌黄鼠的洞穴而捕捉黄鼠。
他采访捕蛇者，详细记述了蕲蛇的外形特征、生活习性、捕猎方法及加工炮炙等。其他如苦荞麦、立蜀黍、刀豆、丝爬之类药物的记述，都是从百姓中采访记载下来的。
李时珍编写《本草纲目》，大量运用了亲身服药的体验，并将服药体验都记录下来。
他亲自服药，很多带有实验性，最能说明问题。如对胡椒、生姜、茗等，既有亲自体验，又加以详论性的记载。同时，还描述了自己患病时用药治愈的事情。
李时珍是一个经验丰富的医师，他的许多临床经验都编辑在《本草纲目》中，有些是他特意进行的试验性治疗，如他记载了一个下痢的药方：“治大人和小孩下痢并且吃一点东西就吐的病，用白蜡、鸡蛋黄、石蜜、苦酒、发灰、黄连末各半。先煎蜜、蜡、苦酒、鸡子四味药，再将黄连、发灰拌入熬成药丸。用两天服尽，神效无比。这种药方用后，经过多次试验都很成功。”
对于家传医药经验，李时珍进行了继承和整理，载入了著作。
而对民间的用药治验，只要是行之有效的药方，李时珍都着意采访，认真记录下来，在他的《本草纲目》中有详细的描述。
有一次在蕲州城内，李时珍看见有一个老婆婆在村里用水杨枝的叶煎汤洗浴帮助痘疹透发，李时珍马上走去向老婆婆询问她所用的方法，然后再自己亲自实验，果然有效，于是将这种方法记录下来了。